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研制岩藻黄质标准样品技术方法(一)

发布日期: 2018-11-06
浏览次数: 87

    岩藻黄质 (fucoxanthin,亦称褐藻黄素 ) 是从 可食用褐藻中,如裙带菜 (Undaria pinnatifida)、海 带 (Laminaria japonica aresch) 和马尾藻 (Sargassum fulvellum) 等提取出来的天然类胡萝卜素。目前已 经证实岩藻黄质具有多种生物学活性,包括抗肿瘤、 抗炎、抗氧化、减肥等[1–5] ,其潜在的活性也正在被科 学家们积极探求之中,目前己成为当今海洋药物研 究与开发的热点之一。然而,由于技术难度等问题, 目前国内尚无岩藻黄质标准样品。笔者从海带中提 取分离纯化获得高纯岩藻黄质,进行标准样品的研 究,为海带及岩藻黄质制剂的后续开发研究提供重要的指标性成分。


 1 实验部分

 1.1 主要仪器与试剂

    高效液相色谱仪:LC–2010AD 型,附带二元高 压梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器,日本岛 津公司;

    红外光谱仪:Nicolet Ftir–670 型,美国 Thermo Scientific 公司; 高 分 辨 质 谱 仪:Lct Premier TM XE 型,美 国 Waters 公司; 天平:AL/104 型,瑞士梅特勒 – 托利多集团; 纯水机:Milli–Q,美国 Millipore 公司; 甲醇:色谱纯,德国默克公司; 实验用水均来自 Milli–Q 纯水系统。

 1.2 岩藻黄质样品的制备 

    以海带为原料,经乙醇提取、硅胶柱层析、高效 液相色谱制备分离、浓缩、冷冻干燥得岩藻黄质高纯 单体。 

1.3 定性分析 

    采用红外吸收光谱、高分辨质谱及核磁共振谱 等对岩藻黄质标准样品进行定性分析。

 1.4 定值分析 

    采用高效液相色谱 – 紫外检测 (HPLC–UV) 法 进行定值分析。 

1.4.1 色谱条件 

    色谱柱:依利特 ODS C18 色谱柱 (250 mm×4.6 mm,5 µm,大连依利特分析仪器有限公司 ) ;流 动 相:甲 醇 – 水 ( 体 积 比 为 90∶10),流 速 为 1.0 mL/min ;检测波长:450 nm ;检测器:紫外检测器; 进样体积:10 mL。 

1.4.2 样品配制 

    打开样品瓶盖子后,精密称取岩藻黄质适量, 用甲醇配制成质量浓度约为 20 µg/mL 的样品溶 液,按照 1.4.1 色谱条件进行纯度检测,每个样品重 复进样 3 次。 

1.5 均匀性检验 

   按照 GB/T 15000.3–2008 [6]规定,确定抽样数 目为 15 个,采用单因素多水平试验方差分析法对岩 藻黄质标准样品进行纯度均匀性检验,测定方法采 用 HPLC–UV 法,每个样品重复测定 3 次。检测数 据用方差分析法进行分析。

 1.6 稳定性检验 

   为了考察样品的稳定性,确定其有效期,取本 标准样品模拟上市包装,进行 –18℃条件下的 24 个 月长期试验。分别于 0,6,12,18,24 个月取样检测, 通过考察标准样品纯度的变化来研究样品的稳定 性。稳定性检测方法与均匀性检测方法相同,均采 用 HPLC–UV 法,每份样品连续进样两次,然后用归 一法求出其纯度的平均值。


2 结果与讨论

 2.1 岩藻黄质的定性分析 

岩藻黄质通过红外光谱、高分辨质谱及核磁共 振谱进行定性分析[7] 。 2.1.1 岩藻黄质的红外光谱分析

研制岩藻黄质标准样品技术方法(一)


2.1.2 岩藻黄质的高分辨质谱分析 

    岩藻黄质化合物加钠离子[C42H58O6+Na]+ 的 理论精确质量数为 681.4131,高分辨质谱测得的精 确质量数为 681.4137,两者数据一致,可以确认该化 合物的分子式为 C42H58O6。


 2.1.3 岩藻黄质的核磁共振谱分析

     化合物岩藻黄质的分子式为 C42H58O6,则不 饱和度 Ω=14。通过分析 13 C NMR 和 DEPT 谱图 可知,14 个不饱和度分别是由 9 个共轭双键、1 个 酮羰基、1 个乙酰氧基、1 个环氧和 2 个六元环组 成。进一步对谱图进行分析可知,化合物岩藻黄 质含有 11 个 CH3,5 个 CH2,2 个次甲基 (CH),3 个 — C H = C H — , 4 个 C C H CH3 , 1 个 C C C H 和 2 个 羰 基 (C=O) 以 及 5 个 季 碳 (C)。结合 1 H NMR 和 HMQC 谱图,岩藻黄质 含有 5 个亚甲基 (CH2)。δ 2.59 和 δ 3.65(d,J=18.4 Hz) 可归属于 7 位碳上的两个质子;δ 1.35~1.41(m, 1H) 和 δ 1.51(1H) 可归属于六元环 2 位碳上的直 立键和平伏键质子;δ 1.76(1H),δ 2.31 (1H) 可归属 于六元环 4 位碳上的直立键和平伏键质子;δ 1.48 (1H),δ 2.00(1H) 可归属于另一个六元环 2' 位碳上的直立键和平伏键质子;δ 1.54(1H),δ 2.30(1H) 可 归属于另一个六元环 4' 位碳上的直立键和平伏键 质子。化合物含有 2 个饱和次甲基 CH,即 δ 3.82 归属为 3 位质子,δ 5.38 归属为 3' 位质子,另外还 有 11 个不饱和双键上的次甲基质子在低场出现峰 δ 7.16~6.06(11H),它们分别归属于 10,11,12,14, 15,8',10',11',12',14',15' 位的双键氢。10 个甲基 质子单峰 δ 1.99×2,δ 1.94,δ 1.81(12H,s,CH3×4) 和 δ 1.38,δ 1.35,δ 1.22,δ 1.07,δ 1.03,δ 0.96(18H, CH3×6) 分 别 归 属 于 20,20',19,19',18',16',18, 17',16,17 位的甲基。根据 HMBC 可知,峰 δ 2.04 (s,CH3) 归属于 22' 的甲基质子与 21' 的酯键组成 的一个乙酰氧基片段,位于六元环直立键位置上。 在 13 C NMR 和 DEPT 中显示岩藻黄质含有 11 个 CH3,5 个 CH2,13 个 CH 以 及 13 个 季 碳。HMQC 谱显示 11 个 CH3 的碳原子与它们的质子对应,δ 25.0 归属为 16 位碳,δ 28.1 归属为 17 位碳,δ 21.1 归属为 18 位碳,δ 11.8 归属为 19 位碳,δ 12.9 归属 为 20 位碳,δ 29.2 归属为 16' 位碳,δ 32.1 归属为 17' 位碳,δ 31.3 归属为 18' 位碳,δ 14.0 归属为 19' 位碳,δ 12.8 归属为 20' 位碳,δ 21.4 归属为 22' 位 碳。5 个 CH2 的碳原子与它们的质子对应,δ 47.1 归属为 2 位碳,δ 41.6 归属为 4 位碳,δ 40.8 归属为 7 位碳,δ 45.4 归属为 2' 位碳,δ 45.2 归属为 4' 位 碳。13 个 CH 由 2 个—O—CH (δ 64.3 归属为 3 位 碳,δ 68.0 归属为 3' 位碳 ) 和 11 个烯碳组成,这 11 个烯碳是 3 个—CHCH—(δ 123.4 归属为 11 位碳, δ 129.4 归属为 12 位碳,δ 128.5 归属为 15 位碳, δ 132.5 归属为 15' 位碳,δ 136.6 归属为 11' 位碳, δ 132.2 归属为 12' 位碳 ),4 个 C C H CH3 (δ 139.1 归 属为 10 位碳,δ 125.7 归属为 14 位碳,δ 137.1 归 属 为 10' 位 碳,δ 139.1 归 属 为 14' 位 碳 ) 和 1 个 C C C H (δ 103.3 归属为 8' 位碳 )。13 个季碳中, 2 个为羰基的碳 (δ 197.8 归属为 8 位碳,δ 170.5 归 属为 21' 位碳 ) ;5 个为饱和烷烃的季碳 (δ 35.1 归 属为 1 位碳,δ 66.2 归属为 5 位碳,δ 67.1 归属为 6 位碳,δ 35.8 归属为 1' 位碳,δ 72.6 归属为 5' 位碳 ) ; 5 个为烯烃的季碳 (δ 134.5 归属为 9 位碳,δ 135.4 归属为 13 位碳,δ 132.5 归属为 9' 位碳,δ 138.1 归 属为 13' 位碳,δ 117.5 归属为 6' 位碳 ) 和 1 个双烯碳 (δ 202.3 归属为 7' 位碳 )。

     HMBC 谱显示 2 位碳与 16,17 位质子有相关; 4 位碳与 3,18 位质子有相关;8 位碳与 7,10,19 位 质子有相关;11 位碳与 10,12 位质子有相关;1' 位 碳与 16',17' 位质子有相关;20' 位碳与 12',14' 位质 子有相关。其余碳与质子的相关性均证实了前述碳 与质子的归属。 

    综上所述,样品的核磁共振氢谱给出了甲基、 亚甲基、次甲基、羰基等信息,各质子的化学位移值 与文献一致;核磁共振碳谱、DEPT、HMQC、HMBC 谱显示碳的类型与该化学结构相符,相关谱均有合 理对应点,各碳的化学位移值与文献一致[8–9] ,结果 见表 2。

研制岩藻黄质标准样品技术方法(一)

研制岩藻黄质标准样品技术方法(一)


综上所述,从样品的红外光谱、高分辨质谱和 核磁共振谱证明了所研制的样品是岩藻黄质。

摘自:<<化学分析计量>>


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